Sekvenciranje: razlika između inačica
Izbrisani sadržaj Dodani sadržaj
Nema sažetka uređivanja |
Do danas je razvijeno više metoda određivanja sekvenci DNK. Ranije je to bilo veliki i skup poduhvat, dok se modernim metodama sekvenciranje danas odvija skoro automatski. |
||
Redak 1:
'''Sekvenciranje''' u genetici je metoda kojom je moguće utvrditi redoslijed pojedinih gradivnih elemenata u velikoj molekuli. Kod [[DNK]] i [[RNK]] utvrđuje se redoslijed [[nukleotidi|nukleotida]], a kod bjelančevina uvrđuje se redoslijed [[aminokiselina|aminokiselina]].
Sekvenciranje DNK je svojevrsan početak istrazivačke revolucije na polju genomike. Od 1995 godine do danas je na taj način sekvenciran [[genom]] 330 različitih organizama među kojima i čovjeka.
Dešifriranje "otključavanje" genetičkog koda direktno na "izvoru", naime na nivou DNK je za naučnika uvijek jedan poseban poduhvat. Ako je DNK sekvenca poznata, moći će se uz pomoć znanja o genetskom kodu direktno odrediti sekvenca aminokiseline kodiranog genprodukta - proteina. Do danas je razvijeno više metoda određivanja sekvenci DNK. Ranije je to bilo veliki i skup poduhvat, dok se modernim metodama sekvenciranje danas odvija skoro automatski. Dvije najznačajnije metode DNK sekvenciranja su:
1.'''Frederick Sanger''' tehnika elegantno koristi prirodni tok replikacije kao uzorak za sekvenciranje i ona je jos uvijek dominantno prisutna.
2. '''Maxim-Gilbert''' tehnika u principu se bazira na kemijskom razlaganju pojedinih baza i u ovom trenutku je vise interesantna u povjesnm trenutku jer se sve rjede koristi.
U novije vrijeme pojavila se metoda tzv. Pirosekvenciranja koja nudi mogućnost ubrzanog sekvenciranja kroz visokoparalelnu aktivnost.
== Sanger sekvencirqanje ==
Sanger je naime razvio dvije metode sekvenciranja nukleinskih kiselina. Ovdje ćemo prikazati jednu od njih - '''dezoxi metodu''' koja se pojavila 1977. godine. DNK replikacija se odvija uz pomoć DNK polimeraze koja "ugrađuje u rastući drugi niz DNK nasuprot lezecem polinukleotidnom lancu (matrici). Međutim ako se umjesto priorodnog nukleotida u postupku replikacije koristi kao prethodnik (2´3´DidesoxyNTP = 2´3´ddNTP), onda će nakon njegove ugradnje replikacija niza bice zavrsena. To znači da nakon njega nece biti vise nijedan nukleotid ugradjen u niz (lanac). Na ovom mjestu će nastati prekid lanca. Za svaku bazu [[nukleotidi|G,T,C, ili A]] postoji jedan odgovarajuci 2´3´ddNTP. Dodamo li "mješavini koja se sekvencionira" - DNK polimerazu, jean lanac polinukleotida jedne DNK, te neophodna 4 odgovarajuce dNTPs, te dodatno jedan ddNTP /npr ddTNP), nakon reakcije će nastati serija DNA lanaca od kojih se svaki završava jednim dezoxi-T.
Da bi se odredile sve četiri baze biti će naravno provedena četiri različita reakcijska postupka. Pri tome će se dobiti dijelovi lanaca (nizovi) različite duzine sa odgovarajućim prisutnim bazama. Na kraju ćemo u svakom reakcijskom postupku elektroforezom u veoma finom acryamidnom gelu selektirati prisutne DNK nizove različite dužine. Ovaj gel ima vrlo veliku rezoluciju tako da je moguće odvojiti DNK nizove jedan od drugoga čak kada se oni razlikuju samo u jednom nukleotidu.
Nizovi (lanci) DNK će biti vidljivi tek što po svakom reakcionom postupku budu radioaktivno markirani. Ako se prema radioaktivno markiranom genetskom materijalu izloži (eksponira) rendgenskom filmu, moći ćemo na njemu u vidu crnih linija (traka) uočiti zapise radioaktivnih DNK nizova. Ako je npr. kod jednog takvog niza baza A-adanin na pozicijama 45,60 i 81 onda će se i na filmu pojaviti crne linije (trake) te veličine. Time će biti dokazano da na toj poziciji u sekvenci DNK stoji adenin. Ako se umjesto radioaktivnog ddATP u reakcionom postupku koristi radioaktivno ddGTP te sadrži nizove dužine npr. 76,97 i 123 značiti će da se na tom mjestu nalazi baza guanin.
Tako se pozicija pojedinačne baze može odrediti na osnovu pozicije označene na rendgenskom filmu u vidu crne traka. Za očitavanje vrijednosti su razvijeni kompjuterski programi tako da je i taj postupak veoma ubrzan i sa velikom točnošću.
Kod Sanger metode moramo još uzeti u obzir komplementarnost baza: Ako je '''A''' ugrađen, onda je naravno osnova na originalnom DNK nizu '''T'''.
== Maxim-Gilbret metoda ==
Maxim-Gilbret metoda (razvijena 1977. godine) se bazira na kemijskoj razgradnji vlastitih baza. Kao prvo, jedan od krajeva DNK mora biti radioaktivno markiran. Zatim će u četiri različite reakcione posude biti realizirani postupci specifičnih razgradnji baza.
Za svaku bazu postoji specifična organsko-kemijska reakcija koja će bazu specifično razgraditi i time će, nakon još jedne kemijske reakcije koja slijedi, izazvati prekid u DNK lancu (nizu) Ponovno će biti dobiveni fragmenti DNK čije će veličine biti točno odredene u procesu DNK gelelektroforeze.
Na osnovu sekvenci baza jedne DNK, moguće je saznati sastav pripadajućeg proteina. Pošto se DNK sekvenciranje odvija brže nego sekvenciranje proteina, danas je najčešće moguće brže upoznati (dešifrirati) sekvence proteina putem DNK sekvenciranja, nego sto je to moguće postići direktnim sekvenciranjem proteina.
DNK sekvenciranje je do danas toliko uznapredovalo, tako da je genetski materijal mnogih organizama već u potpunosti sekvenciran (npr. mnoge bakterije, kvasci, a početkom 2004. godine dešifriran je i [[genom]] čovjeka.
== Pirosekvenciranje ==
== Sekvenciranje uz pomoć hibridiziranja ==
[[Kategorija:Genetika]]
| |||